การย้อมสีแกรมเป็นเทคนิคที่รวดเร็วและใช้เพื่อดูการมีอยู่ของแบคทีเรียในตัวอย่างเนื้อเยื่อ และเพื่อจำแนกแบคทีเรียเป็นแกรมบวกหรือแกรมลบ โดยพิจารณาจากคุณสมบัติทางเคมีและทางกายภาพของผนังเซลล์ คราบแกรมมักถูกใช้เป็นขั้นตอนแรกในการวินิจฉัยการติดเชื้อแบคทีเรีย
เทคนิคการย้อมสีนี้ตั้งชื่อตามนักวิทยาศาสตร์ชาวเดนมาร์ก Hans Christian Gram (1853 - 1938) ผู้พัฒนาเทคนิคนี้ในปี 1882 และตีพิมพ์ในปี 1884 เพื่อเป็นเทคนิคในการแยกแยะระหว่างแบคทีเรียสองชนิดที่มีอาการทางคลินิกคล้ายคลึงกัน: Streptococcus pneumoniae (หรือที่เรียกว่า Streptococcus pneumoniae) pneumococci) และแบคทีเรีย Klebsiella pneumoniae
ขั้นตอน
วิธีที่ 1 จาก 3: การเตรียมสไลด์ไมโครสโคป
ขั้นตอนที่ 1. เตรียมตัวทำงานในห้องปฏิบัติการ
สวมถุงมือและผูกผมยาวเพื่อป้องกันการปนเปื้อนของแบคทีเรียในตัวอย่างที่คุณกำลังทดสอบ ทำความสะอาดพื้นที่ทำงานภายใต้ตู้ดูดควันหรือในบริเวณอื่นที่มีอากาศถ่ายเทสะดวก ตรวจสอบหัวเผา Bunsen และตรวจดูให้แน่ใจว่ากล้องจุลทรรศน์ทำงานอย่างถูกต้องก่อนเริ่มใช้งาน
ขั้นตอนที่ 2. ฆ่าเชื้อสไลด์แก้วกล้องจุลทรรศน์
หากกระจกสไลด์สกปรก ให้ล้างด้วยน้ำสบู่เพื่อขจัดน้ำมันและสิ่งสกปรก ทำความสะอาดสไลด์ด้วยเอทานอล น้ำยาเช็ดกระจก หรือวิธีอื่นที่ห้องปฏิบัติการของคุณใช้
ขั้นตอนที่ 3 วางตัวอย่างลงบนสไลด์แก้ว
คุณสามารถใช้เทคนิคคราบแกรมเพื่อช่วยระบุแบคทีเรียในตัวอย่างทางการแพทย์ หรือการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียที่เติบโตในจานเพาะเชื้อ เพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด ให้ใช้แกรมสเตนบนเส้นบางๆ ของตัวอย่าง ขอแนะนำให้ใช้ตัวอย่างที่มีอายุน้อยกว่า 24 ชั่วโมง เนื่องจากแบคทีเรียที่มีอายุมากกว่าอาจทำให้ผนังเซลล์เสียหายและอาจไม่ตอบสนองต่อการย้อมแบบแกรม
- หากใช้ตัวอย่างทิชชู่ ให้เติม 1-2 หยดลงในสไลด์แก้ว กระจายตัวอย่างเท่าๆ กันบนสไลด์เพื่อสร้างชั้นบางๆ ของการโรยตัวอย่าง โดยการเลื่อนโดยใช้ขอบของสไลด์แก้วปลอดเชื้ออีกอัน ปล่อยให้แห้งก่อนทำขั้นตอนต่อไป
- หากคุณกำลังนำแบคทีเรียจากจานเพาะเชื้อ ให้ฆ่าเชื้อวงจรการเพาะเชื้อในหัวเผาบุนเซ็นจนเรืองแสง จากนั้นปล่อยให้เย็น ใช้ห่วงหยดน้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วลงบนสไลด์ จากนั้นฆ่าเชื้อและทำให้เย็นอีกครั้งก่อนนำไปใช้เพื่อเก็บตัวอย่างแบคทีเรียจำนวนเล็กน้อย หลังจากนั้นคนเบา ๆ
- แบคทีเรียที่เตรียมในน้ำซุปจะต้องกวนอีกครั้งโดยใช้เครื่องวอร์เท็กซ์เจอร์ จากนั้นจึงถ่ายด้วยวงรอบการเพาะเชื้อตามที่กล่าวไว้ข้างต้น โดยไม่ต้องเติมน้ำ
- หากคุณมีตัวอย่างสำลี (โดยปกติใช้ด้ามสำลีขนาดเล็ก) ให้แตะและค่อยๆ หมุนสำลีบนสไลด์
ขั้นตอนที่ 4 อุณหภูมิที่สูงเล็กน้อยสามารถทำให้เกิดรอยเปื้อนได้ดี
ความร้อนจะทำให้แบคทีเรียเกาะอยู่บนสไลด์ จึงไม่ละลายง่ายระหว่างขั้นตอนการย้อม แตะสไลด์อย่างรวดเร็วสองถึงสามครั้งบนเตา Bunsen หรือให้ความร้อนสไลด์บนเครื่องทำความร้อนแบบสไลด์ไฟฟ้า อย่าให้ความร้อนสูงเกินไป ตัวอย่างอาจเสียหายได้ หากคุณกำลังใช้หัวเผาบุนเซ็น ควรใช้ไฟขนาดเล็กแต่เป็นสีน้ำเงินแทนที่จะเป็นเปลวไฟสีส้มขนาดใหญ่
อีกวิธีหนึ่ง การทำสเมียร์สามารถทำได้ด้วยเมทานอล โดยการเติมเมทานอล 1-2 หยดลงในสเมียร์แบบแห้ง ทำให้เมทานอลที่เหลืออยู่บนสไลด์แห้งโดยปล่อยทิ้งไว้ในที่โล่ง เทคนิคนี้ช่วยลดความเสียหายของเซลล์และให้พื้นหลังภาพสไลด์ที่สะอาดตา
ขั้นตอนที่ 5. วางสไลด์บนถาดสี
ถาดรองสีทำจากโลหะ แก้ว หรือแผ่นพลาสติกตื้นที่มีตาข่ายนุ่มซับอยู่ด้านบน วางแผ่นสไลด์ไว้บนตาข่ายเหล่านี้ เพื่อให้ของเหลวที่คุณใช้ระบายลงในถาดได้
หากคุณไม่มีถาดสี คุณสามารถวางสไลด์บนถาดพลาสติกเพื่อพิมพ์ก้อนน้ำแข็ง
วิธีที่ 2 จาก 3: กระบวนการย้อมแกรม
ขั้นตอนที่ 1. เทของเหลวคริสตัลไวโอเล็ตลงบนสเมียร์
ใช้ปิเปตพ่นตัวอย่างแบคทีเรียด้วยสีย้อมคริสตัลไวโอเล็ต 2-3 หยด หรือที่เรียกว่าเจนเชียน ไวโอเลต ทิ้งไว้ 30-60 วินาที คริสตัลไวโอเล็ต (KV) แยกในสารละลายในน้ำออกเป็น KV+ และคลอไรด์ (Cl-) ไอออน ไอออนเหล่านี้เจาะผนังเซลล์และเยื่อหุ้มเซลล์ของแบคทีเรียแกรมบวกและแกรมลบ ไอออน KV+ ทำปฏิกิริยากับส่วนประกอบที่มีประจุลบของเซลล์แบคทีเรีย ทำให้เซลล์มีสีม่วง
ห้องปฏิบัติการหลายแห่งใช้คริสตัลไวโอเล็ต "ฮัคเกอร์" ซึ่งประกอบด้วยแอมโมเนียมออกซาเลตเพื่อป้องกันการตกตะกอน
ขั้นตอนที่ 2. ล้างคริสตัลไวโอเล็ตเบาๆ
เอียงสไลด์และใช้ขวดล้างเพื่อฉีดน้ำกลั่นหรือน้ำประปาปริมาณเล็กน้อยบนสไลด์ น้ำควรไหลลงบนพื้นผิวของรอยเปื้อน และไม่ควรฉีดลงบนรอยเปื้อนโดยตรง อย่าล้างมากเกินไป สามารถขจัดคราบแบคทีเรียแกรมบวกได้
ขั้นตอนที่ 3 ล้างสเมียร์ด้วยไอโอดีนแล้วล้างออก
ใช้หยดเพื่อล้างรอยเปื้อนด้วยไอโอดีน ทิ้งไว้อย่างน้อย 60 วินาที แล้วล้างออกด้วยความระมัดระวังในลักษณะเดียวกับข้างต้น ไอโอดีน ในรูปของไอออนที่มีประจุลบ ทำปฏิกิริยากับ KV+ เพื่อสร้างสารประกอบเชิงซ้อนขนาดใหญ่ระหว่างคริสตัลไวโอเล็ตและไอโอดีน (สารประกอบเชิงซ้อน CV-I) ในชั้นในและชั้นนอกของเซลล์ สารประกอบเชิงซ้อนนี้จะคงสีม่วงของคริสตัลไวโอเล็ตไว้ภายในเซลล์ ณ ตำแหน่งที่เปื้อน
ไอโอดีนเป็นสารกัดกร่อน หลีกเลี่ยงการสูดดม การกลืนกิน หรือสัมผัสกับผิวหนัง
ขั้นตอนที่ 4. เติมสารฟอกสีแล้วล้างออกอย่างรวดเร็ว
มักใช้ส่วนผสมของอะซิโตนและเอทานอลในอัตราส่วน 1:1 สำหรับขั้นตอนสำคัญนี้ ซึ่งต้องจับเวลาอย่างระมัดระวัง จัดตำแหน่งสไลด์ในมุมหนึ่ง จากนั้นเติมสารฟอกสีจนมองไม่เห็นสีม่วงในน้ำที่ใช้ล้าง โดยปกติจะใช้เวลาน้อยกว่า 10 วินาทีหรือน้อยกว่านั้นหากสารฟอกขาวมีอะซิโตนเข้มข้น หยุดขั้นตอนนี้ทันที ไม่เช่นนั้นสีย้อมจะชะล้างคริสตัลไวโอเลตออกจากเซลล์แกรมบวกและลบด้วย และต้องทำซ้ำขั้นตอนการย้อม ล้างสารฟอกสีส่วนเกินออกทันทีโดยใช้เทคนิคก่อนหน้านี้
- สามารถใช้อะซิโตนบริสุทธิ์ (95%+) แทนได้ ยิ่งคุณใช้อะซิโตนมาก สารฟอกขาวก็จะทำงานเร็วขึ้น ดังนั้น คุณจึงต้องให้ความสำคัญกับเวลามากขึ้น
- หากคุณมีปัญหาในการติดตามเวลาสำหรับขั้นตอนนี้ ให้เพิ่มสารฟอกสีทีละหยด
ขั้นตอนที่ 5. โรยเคาน์เตอร์-ย้อมบนสเมียร์ แล้วล้างออก
เคาน์เตอร์สเตน ปกติคือ safranin หรือ fuchsin ใช้เพื่อเพิ่มคอนทราสต์ระหว่างแบคทีเรียแกรมลบและแกรมบวก โดยการย้อมสีแบคทีเรียที่ทำให้เสียสี เช่น แบคทีเรียแกรมลบ สีชมพูหรือสีแดง ปล่อยทิ้งไว้อย่างน้อย 45 วินาที แล้วล้างออก
Fuchsin จะทำการย้อมแบคทีเรียแกรมลบจำนวนมาก เช่น Haemophilus spp และ Legionella spp. วิธีนี้เหมาะสำหรับผู้เริ่มต้น
ขั้นตอนที่ 6 เช็ดสไลด์ให้แห้ง
คุณสามารถทำให้แห้งในที่โล่งเพื่อทำให้แห้ง หรือใช้กระดาษ bibulous ที่ขายเพื่อการนี้ ขั้นตอนการย้อมสี Gram เสร็จสมบูรณ์
วิธีที่ 3 จาก 3: การตรวจสอบผลลัพธ์การระบายสี
ขั้นตอนที่ 1. เตรียมกล้องจุลทรรศน์แสง
วางสไลด์ไว้ใต้กล้องจุลทรรศน์ แบคทีเรียมีขนาดแตกต่างกันมาก ดังนั้นกำลังขยายทั้งหมดที่ต้องการจะแตกต่างกันไปตั้งแต่ 400x ถึง 1000x แนะนำให้ใช้เลนส์ใกล้วัตถุที่มีน้ำมันแช่เพื่อให้ภาพที่คมชัดยิ่งขึ้น หยดน้ำมันแช่ลงบนสไลด์เพื่อหลีกเลี่ยงการเคลื่อนไหวในขณะที่หยดเพื่อป้องกันไม่ให้เกิดฟอง เลื่อนที่จับเลนส์ไมโครสโคปเพื่อให้เลนส์ใกล้วัตถุเข้าที่และสัมผัสกับน้ำมัน
การแช่น้ำมันสามารถใช้ได้กับเลนส์ที่ออกแบบมาเป็นพิเศษเท่านั้น ไม่สามารถใช้กับเลนส์ "แห้ง"
ขั้นตอนที่ 2 พยายามระบุแบคทีเรียแกรมบวกและแกรมลบ
ตรวจสอบสไลด์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง แบคทีเรียแกรมบวกมีสีม่วง เนื่องจากคริสตัลไวโอเล็ตติดอยู่ภายในผนังเซลล์หนา แบคทีเรียแกรมลบจะเป็นสีชมพูหรือสีแดง เพราะคริสตัลไวโอเล็ตจะถูกชะล้างออกทางผนังเซลล์บาง ๆ ซึ่งสีย้อมสีชมพูจะเข้ามา
- หากตัวอย่างหนาเกินไป ผลลัพธ์อาจเป็นผลบวกลวง ย้อมตัวอย่างใหม่หากพบว่ามีแบคทีเรียแกรมบวกทั้งหมด เพื่อให้แน่ใจว่าผลลัพธ์ถูกต้อง
- หากคุณใช้สารฟอกสีมากเกินไป ผลลัพธ์อาจเป็นค่าลบที่ผิดพลาดได้ ย้อมตัวอย่างใหม่หากพบว่ามีแบคทีเรียแกรมลบทั้งหมด เพื่อให้แน่ใจว่าผลลัพธ์ถูกต้อง
ขั้นตอนที่ 3 เปรียบเทียบผลลัพธ์ที่คุณเห็นกับรูปภาพอ้างอิง
หากคุณไม่รู้ว่าแบคทีเรียมีลักษณะอย่างไร ให้ศึกษาคอลเล็กชันภาพอ้างอิง ซึ่งโดยปกติแล้วจะจัดเรียงตามรูปร่างและคราบแกรม คุณยังสามารถดูฐานข้อมูลออนไลน์ได้ที่ [ฐานข้อมูลจุลินทรีย์ก่อโรคแห่งชาติ แบคทีเรียในภาพถ่าย และเว็บไซต์ออนไลน์อื่น ๆ อีกมากมาย เพื่ออำนวยความสะดวกในการระบุตัวตน ด้านล่างนี้คือตัวอย่างแบคทีเรียที่พบได้ทั่วไปหรือมีความสำคัญต่อการวินิจฉัย โดยจำแนกตามสถานะและรูปร่างของแกรม
ขั้นตอนที่ 4 ระบุแบคทีเรียแกรมบวกตามรูปร่าง
แบคทีเรียถูกจำแนกเพิ่มเติมตามรูปร่างของพวกมันภายใต้กล้องจุลทรรศน์ โดยทั่วไปจะเป็น cocci (ทรงกลม) หรือแท่ง (ทรงกระบอก) ต่อไปนี้คือตัวอย่างบางส่วนของแบคทีเรียแกรมบวก (สีม่วง) ตามรูปร่างของพวกมัน:
- กรัมบวก cocci มักเป็น Staphylococci (หมายถึงกลุ่ม cocci) หรือ streptococci (หมายถึง chain cocci)
- ' แท่งแกรมบวกเช่น Bacillus, Clostridium, Corynebacterium และ Listeria แบคทีเรียชนิดแท่ง Actinomyces spp. มักจะมีกิ่งก้านหรือเส้นใย
ขั้นตอนที่ 5. ระบุแกรมลบแบคทีเรีย
แบคทีเรียแกรมลบ (สีชมพู) มักแบ่งออกเป็นสามกลุ่ม Cocci มีรูปร่างเป็นทรงกลมแท่งยาวและบางในขณะที่แท่ง coccoid อยู่ระหว่างนั้น
- กรัมเชิงลบ cocci ที่พบมากที่สุดคือ Neisseria spp.
- แท่งแกรมลบ เช่น E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas และอื่นๆ อีกมากมาย Vibrio cholerae สามารถมองเห็นได้เป็นลำต้นปกติหรือลำต้นงอ
- แบคทีเรียก้าน "coccoid" (หรือ "coccobacilli") แกรมลบ เช่น Bordetella, Brucella, Haemophilus และ Pasteurella
ขั้นตอนที่ 6 ตรวจสอบอย่างรอบคอบว่าผลลัพธ์มีการผสมกันหรือไม่
แบคทีเรียบางชนิดทำสีได้ยาก เนื่องจากผนังเซลล์มีความเปราะบางหรือเป็นขี้ผึ้ง แบคทีเรียเหล่านี้อาจแสดงส่วนผสมของสีม่วงหรือชมพูในเซลล์เดียวกัน หรือระหว่างเซลล์ต่างๆ ในสเมียร์เดียวกัน ตัวอย่างแบคทีเรียที่มีอายุมากกว่า 24 ชั่วโมงสามารถแสดงปัญหานี้ได้ แต่ก็มีแบคทีเรียบางชนิดที่ยังคงสีได้ยากในทุกช่วงอายุของการสุ่มตัวอย่าง แบคทีเรียเหล่านี้ต้องการการทดสอบเฉพาะทางเพื่อระบุตัวตน เช่น การย้อมสีอย่างรวดเร็วของกรด การสังเกตในการเพาะเชื้อแบคทีเรีย สื่อการเพาะเชื้อ TSI หรือการทดสอบทางพันธุกรรม
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium และ Propionibacterium spp. ทั้งหมดเป็นแบคทีเรียแกรมบวก แต่มักไม่เปื้อนอย่างชัดเจน
- แบคทีเรียรูปร่างเพรียวขนาดเล็ก เช่น Treponema, Chlamydia และ Rickettsia spp. ย้อมยากด้วยวิธีแกรม
ขั้นตอนที่ 7 กำจัดวัสดุสิ้นเปลืองและอุปกรณ์ที่เหลืออยู่
ขั้นตอนการกำจัดของเสียนี้แตกต่างกันไปในแต่ละห้องปฏิบัติการและขึ้นอยู่กับวัสดุที่ใช้ โดยปกติ ของเหลวในถาดย้อมสีจะถูกกำจัดในขวดที่ระบุว่าเป็นของเสียอันตราย แช่สไลด์ในสารละลายฟอกขาว 10% แล้วทิ้งในภาชนะที่มีคม
เคล็ดลับ
- โปรดจำไว้ว่าผลลัพธ์ของคราบแกรมจะดีก็ต่อเมื่อตัวอย่างนั้นดี สิ่งสำคัญคือต้องแจ้งให้ผู้ป่วยทราบเพื่อให้สามารถจัดเตรียมตัวอย่างที่ดี (เช่น ความแตกต่างระหว่างการคายกับไอลึกเพื่อให้ได้ตัวอย่างเสมหะ)
- เอทานอลทำปฏิกิริยาช้ากว่าอะซิโตนในฐานะสารฟอกสี
- ปฏิบัติตามข้อบังคับห้องปฏิบัติการมาตรฐานเพื่อความปลอดภัย
- ใช้สำลีปัดแก้มเพื่อฝึกฝน เพราะมันมีทั้งแบคทีเรียแกรมบวกและแกรมลบ หากคุณพบแบคทีเรียเพียงชนิดเดียว แสดงว่าคุณอาจใช้สารฟอกขาวน้อยเกินไปหรือมากเกินไป
- คุณสามารถใช้ตะขอไม้เพื่อยึดสไลด์ได้
คำเตือน
- อะซิโตนและเอทานอลเป็นสารไวไฟ อะซิโตนจะขจัดน้ำมันออกจากมือคุณ ทำให้ผิวดูดซับสารเคมีอื่นๆ ได้ง่ายขึ้น สวมถุงมือและใช้ด้วยความระมัดระวัง
- อย่าให้รอยเปื้อนแห้งก่อนที่คุณจะล้างคราบแกรมหรือรอยเปื้อนออก
สิ่งที่คุณต้องการ
- ตัวอย่างเครือข่าย
- สไลด์แก้ว
- ปิเปต
- แหล่งกำเนิดไฟขนาดเล็กหรือเครื่องทำความร้อนแบบสไลด์หรือเมทานอล
- น้ำ
- คริสตัลไวโอเล็ต
- ไอโอดีน
- สารฟอกสี เช่น แอลกอฮอล์หรืออะซิโตน
- ซาฟรานิน